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样品制备是高倍生物显微镜重要的因素
点击次数:106 发布时间:2019-05-23
   样品制备是高倍生物显微镜重要的因素,因为它影响从样品本身的保存到可以获得的信息种类的一切。在开始电子显微镜项目之前,确定对样品提出的问题是至关重要的。可以进行一个假设驱动的研究,不仅可以节省很多钱,还可以让更快地获得有意义的结果。简而言之,应该为你的样本类型和你要问的问题优化样本准备。
  任何生物EM样品制备的第一步都是固定。固定是一种方法,通过后续的处理和成像阶段,使生物标本的所有代谢过程停止并尽可能地保持在接近生命状态。固定方式主要有两种:化学固定和冷冻固定。
  化学固定
  化学固定是生物EM最常用和最简便的固定方法,化学物质一旦应用于生物样品,就会在氨基酸、蛋白质和脂类之间形成交联,通常是以共价键的形式。化学固定比通常用于光学显微镜的凝固性固定剂(如溶剂和乙酸)更能保存形态学。然而,化学固定也会导致蛋白质变性,这在下游抗体标记技术中可能存在问题。当使用相关的光学和电子显微镜(CLEM),这将是一个挑战。
  有几种化学物质被广泛用于初次固定,包戊二醛和醛引起蛋白质广泛、快速和交联。可能应用戊二醛作为固定剂,然而,它渗透到样品中很慢,在此期间可能发生组织降解。因此,许多研究人员选择戊二醛与甲醛结合,甲醛能迅速穿透样品,提供了一种暂时的蛋白质交联,随后戊二醛取代了这种交联。
  固定剂必须应用于缓冲溶液中的样品,缓冲溶液是固定剂的等渗载体,可防止细胞收缩或膨胀,从而使样品尽可能接近于活的状态。缓冲溶液的渗透压可以根据样品进行调整。
  高倍生物显微镜通常采用二次固定步骤,尤其是TEM样品制备。si氧化锇是常见的二次固定剂,它具有保存脂质膜的优点,而不只是醛固定。它还充当着色剂,为样品提供了大量的对比度和导电性。

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